快三平台开户

您好,欢迎来到快三平台开户APP下载快三平台开户平台 网! [登录] [免费注册]
快三平台开户APP下载快三平台开户平台
网
位置:快三平台开户 > 资料中心 > 行业百科
百科分类
快三平台开户APP下载
快三平台开户平台
分析快三平台开户平台
实验室常用设备
光学快三平台开户平台 及设备
物性测试快三平台开户平台 及设备
测量/计量快三平台开户平台
环境监测快三平台开户平台
生命科学快三平台开户平台
行业专用快三平台开户平台
工业在线及过程控制快三平台开户平台
耗材与配件
设备
化工设备
原料、中间体、气体
原料、中间体
农用化学品
PCR快三平台开户APP下载
什么是PCR?

快三平台开户聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,简称PCR,又称多聚酶链式反应),是一种分子生物学技术,用于扩增特定的DNA片段,这种方法可在生物体外进行,不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

快三平台开户凯利·穆利斯(Kary Mullis)于1983年开发,当时他是Cetus公司的雇员,也是1993年诺贝尔化学奖的获得者,它是一种简单,廉价和可靠的方法复制DNA片段,这个概念适用于现代生物学和相关科学的许多领域。 PCR可能是分子生物学中使用最广泛的技术。这种技术被用于生物医学研究,犯罪取证和分子考古学。

微生物复制是一个费时耗力的流程,首先要将DNA经限制酶剪裁,再利用连接酶(Ligase)加到运载体(Vector)中,之后利用瞬间电击(Electroporation)或是热休克(Heat Shock)的方式,送到大肠杆菌感受态细胞(competent cell)中,将此菌于培养皿大量繁殖培养,再经过繁复的分离、纯化过程,时间通常需要近一周,才能大量复制片段。所以仅需一小时的PCR能节省大量时间和繁复的操作,聚合酶链式反应技术被广泛地运用在医学和生物学的实验室,例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制,以及亲子鉴定。

常用PCR技术种类

1、反向PCR技术(Inverse PCR,IPCR)

反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA。后酶切片段自身环化。以环化的DNA作为模板,用一对与已知序列两端特异性结合的引物,扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化,可以得到大小不同的模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段。

2、锚定PCR技术(Anchored PCR,APCR)

用酶法在一通用引物反转录cDNA3'-末端加上一段已知序列,然后以此序列为 引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。

3、不对称PCR技术(asymmetric PCR)

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50~100:1比例。在最初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

4、反转录PCR技术(reversetranscription PCR,RT-PCR)

当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

5、巢式PCR技术(NEST-PCR)

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR 带,此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤,同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR,主要用于极少量DNA模板的扩增。

6、多重PCR技术(multiplex PCR)

在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的 电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

7、重组PCR技术

重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5'-端和3'-端引物上带上一段互 补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

8、原位PCR技术

利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的 检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增,可进行细胞内定位,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。

9、荧光定量实时PCR技术

实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加。相反,终点法检测(也称“读板检测”)测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

传统PCR、实时荧光定量PCR与数字PCR对比
PCR方法传统PCR实时荧光定量PCR
数字PCR
定义在 PCR 循环结束时测量积聚的 PCR 产物的量。在发生 PCR 扩增时进行测量。测量阴性平行样的比例以确定绝对拷贝数。
是否定量

但是比较凝胶上的扩增条带的强度与已知浓度的标准品可为您提供“半定量”结果。

因为在 PCR 的指数(对数)期内采集数据,在此期间 PCR 产物的数量与核酸模板的量成正比。

阴性 RCR 反应的比例适合泊松统计算法。

方法应用

·测序

·基因分型

·分子克隆

·基因表达定量

·芯片验证

·质量控制和检测验证

·病原体检测

·SNP 基因分型

·拷贝数变异

·microRNA 分析

·病毒定量

·siRNA/RNAi 实验

·病毒载荷绝对定量

·核酸标准品绝对定量

·下一代测序文库绝对定量

·稀有等位基因检测

·基因表达绝对定量

·混合物富集和分离

方法优缺点

缺点:

·精确度差

·灵敏度低

·动态范围小 < 2 logs

分辨率低

·非自动化

·仅限基于规格的区别分析

·结果未表示为数字

·使用溴化乙锭染色不足以定量

·PCR 后处理

优点:

·提高检测的动态范围

·无需 PCR 后处理

·检测能够覆盖低至 2 倍的变化

·在 PCR 的指数期内采集数据

·报告基团荧光信号的增加与生成的扩增子数量成正比

·裂解探针提供扩增子的永久裂解记录

优点:

·无需依赖参考物或标准品

·通过增加 PCR 平行样的总数可实现所需的精度

·高度耐受抑制剂

·能够分析复杂混合物

·与传统 qPCR 不同,数字 PCR 对出现的拷贝数呈线性反应,可以检测到较小倍数变化的差异。


上一篇:脱氨酶
下一篇:放射性免疫检测
相关产品